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Auto-Hemoterapia - Informações e Debate - Ver Opinião - Ver Opinião - Participação
3961
Sexta-feira, 23 de abril de 2010 - 20:59:43
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MAIS UM EMAIL enviado pela k 

 

Veja essa, sobre a ação macrofágica nas feridas causadas por diabetes, dá pra entender o porque a aht age com tanta eficácia nestes casos... são artigos longos, mas vale a leitura... complementam os estudos para a compreensão da ação da aht, e como não temos pretensão de ter 'palavra final' podemos estudar a vontade.... 

 

 

PESQUISA ARTIGO 

Disfunção macrofágica danifica resolução da inflamação nas feridas de ratos diabéticos 

 

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Savita Khanna , Sabyasachi Biswas , Yingli Shang , Collard Eric , Ali Azad , Courtney Kauh , Bhasker Vineet , Gayle Gordillo M. , Chandan K. Sen , Roy Sashwati * 

 

Centro Integral de Feridas, Departamento de Cirurgia, Davis Coração e Instituto de Investigação Pulmonar, The Ohio State University Medical Center, Columbus, Ohio, Estados Unidos da América 

Resumo Top 

Fundo 

 

A inflamação crônica é uma característica do diabético feridas cutâneas. Buscou-se delinear novos mecanismos envolvidos na diminuição da resolução da inflamação em pacientes diabéticos feridas cutâneas. No local da ferida, o afastamento de células mortas efferocytosis eficiente () é um pré-requisito para a resolução atempada de inflamação e cicatrização bem sucedida. 

Metodologia / Principais Conclusões 

 

Macrófagos isolados de feridas de camundongos diabéticos mostraram uma piora significativa na efferocytosis. efferocytosis prejudicada foi associada com a carga significativamente maior de células em apoptose no tecido da ferida, bem como maior expressão de citocinas pró-inflamatórias e menor expressão de citocinas anti-inflamatórias. Observações relacionadas com a carga celular por apoptose no local da ferida em ratos foram validados na ferida dos tecidos de pacientes diabéticos e não diabéticos. Fas ligand conduzido forçado a elevação da carga celular por apoptose no local da ferida resposta aumentada de citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatória atenuada. Além disso, efferocytosis sucesso ligado ferida macrófagos de pró-inflamatórias para o modo anti-inflamatório. 

Conclusões Significado / 

 

Tomados em conjunto, este estudo apresenta primeira evidência que demonstra que as feridas diabéticas sofrem efferocytosis macrófagos disfuncionais, resultando em aumento da carga de células apoptóticas no local da ferida. Esta carga, por sua vez, prolonga a fase inflamatória e dificulta a cicatrização de feridas. 

 

Citação: S Khanna, S Biswas, Shang Y, Collard E, Azad A, et al. (2010), disfunção dos macrófagos danifica resolução da inflamação nas paredes dos ratos diabéticos. PLoS ONE 5 (3): e9539. Doi: 10.1371/journal.pone.0009539 

 

Editor: Neeraj Vij, Johns Hopkins School of Medicine, Estados Unidos da América 

 

Recebido: 13 outubro de 2009; aceites: 11 de fevereiro de 2010; : Publicado em 04 de marco de 2010 

 

Copyright: © 2010 Khanna et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da atribuição das licenças Creative Commons, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor ea fonte originais são creditados. 

 

Financiamento: Este trabalho foi suportado pelo National Institutes of Health (NIH) RO1 DK076566 prêmio para o SR, e em parte por GM077185 para CKS ( http://www2.niddk.nih.gov/ ). Os financiadores não tiveram nenhum papel no estudo de concepção, recolha e análise, a decisão de publicar, ou a preparação do manuscrito. 

 

O conflito de interesses: Os autores declaram que não existem interesses conflitantes. 

 

* E-mail: @ sashwati.roy osumc.edu 

Introdução Início 

 

O Centers for Disease Control and Prevention (CDC) relatam que o diabetes afeta cerca de 21 milhões de americanos ou seja, ~ 7% da população E.U.. Comprometimento da cicatrização de feridas cutâneas é uma complicação debilitante comumente encontradas durante a diabetes mellitus. úlceras do pé diabético representa a prevalência feridas mais e freqüentemente levam à amputação de membros. A incidência de lesões de pé diabético foi relatado para ser semelhantes em tipo 1 vs pacientes diabéticos tipo 2 [1]. Em humanos úlceras diabéticas, vários desvios de cura normal, foram identificadas (revisto em [2]úlceras diabéticas. caracterizam-se por um estado crônico inflamatório manifesta principalmente por desequilíbrios no pró e anti-inflammatory cytokines [3]. Transient auto-inflamação de resolução é essencial para a cicatrização de sucesso . inflamação da ferida é conduzido por uma variedade de mediadores que são controlados firmemente no espaço e no tempo [4], [5]. site macrófagos-Wound representam um papel fundamental que a inflamação da ferida unidade. diabetes é conhecido por comprometer a função dos macrófagos, incluindo a atividade de fagocitose [6], [7]. macrófagos Diabetic produzir altos níveis de pro citocinas inflamatórias, [8], [9]. Os fatores causais subjacentes ao estado crônico inflamatória de feridas de diabéticos continuam a ser caracterizadas. 

 

Durante a fase inicial inflamatória, um grande número de polimorfonucleares neutrófilos (PMN quase 50% de todas as células no local da ferida) são recrutados para o local da ferida [10]. Após a conclusão das suas tarefas, o PMN deve ser eliminada a fim de iniciar a próxima fase da cicatrização. Não resolver a inflamação persistente pode descarrilar a cascata de cicatrização, resultando em feridas crônicas. No decurso da cicatrização de feridas cutâneas adulto, tecido de granulação diminui na celularidade e evoluir para uma cicatriz [11]. Rápido aumento da infiltração de células durante a reconstrução do tecido é equilibrada por apoptose. Apoptosis permite a eliminação de células que não são mais necessários no local da lesão ou células que são demasiado danificado para facilitar o processo de cicatrização. Os mecanismos de apoptose têm sido intensamente estudados, os mecanismos específicos de eliminação ou afastamento de células apoptóticas do local da ferida permanece mal compreendido[12]. 

 

Fagocitose de células apoptóticas tem características morfológicas distintivas e únicas consequências a jusante. deCathelineau e Henson [13]e Gardai et al [14]cunhou o termo efferocytosis [15]. Efferocytosis refere-se a fagocitose de células apoptóticas, uma característica essencial da resposta imune e críticas para a resolução da inflamação. Esta etapa de remoção final com a morte celular programa desempenha um papel crítico na proteção de tecidos da exposição a conteúdos tóxicos de células que morrem e também serve para prevenir danos de tecido adicional estimulando a produção de citocinas anti-inflamatórias e quimiocinas [16], [17]. Inadequado apuramento de corpos de células pode levar a doenças auto-imunes e inflamação crônica [18]. Adequada remoção de PMNs apoptóticos por macrófagos da ferida é um pré-requisito para a restauração da função do tecido normal resolver a inflamação. No tratamento clínico de feridas crônicas, desbridamento é comumente praticada e destina-se a remoção dos mortos, danificados ou tecidos infectados para melhorar o potencial de cura do tecido saudável remanescente. Postulamos que, no local da ferida, desbridamento de sucesso a nível celular é um pré-requisito para a resolução da inflamação e cura bem sucedida. O objetivo deste estudo foi testar a hipótese de romance e delinear os mecanismos que estão envolvidos na diminuição da resolução da inflamação em feridas diabéticas. Este relatório apresenta dados recolhidos em primeira funcionalmente ativa os macrófagos colhidos feridas diabéticas. 

Resultados Topo 

 

Camundongos homozigotos (BKS.Cg-m + / + Leprdb / J ou db / db) de mutação espontânea do receptor da leptina (Lepr db ) tornam-se obesos identifiably cerca de 3-4 semanas de idade. Elevação do açúcar no sangue era evidente dentro de 4-8 semanas após o nascimento. Excisional (6 mm) criou feridas nas costas destes ratos mostrou comprometimento acentuado no encerramento, quando comparado ao seu controle correspondente (heterozigoto db / +) ratos (dados não mostrados). Utilizando as abordagens histológico, observou-se que as feridas de camundongos diabéticos possuíram maior número de células apoptóticas em comparação com o tecido, de controle db / + camundongos ( Figs. 1A-B ). TUNEL e Western blot usando coloração ativa caspase-3 anticorpo demonstrado resultados consistentes ( Fig. 1C-E ). Para testar a relevância clínica do acima disse que os resultados de biópsias punch (3 mm) foram coletados a partir de correspondência (características do paciente, ferida localização e condição clínica) as feridas do consentimento e não-diabéticos, pacientes diabéticos ( Tabela 1 ). A pontuação de caspase 3 ativa células positivas demonstraram uma maior carga significativa da apoptose no tecido, de indivíduos com diabetes (1F-G). A fim de identificar os tipos de células nas feridas diabéticas que estavam em apoptose, estudos de imunofluorescência dupla foram realizadas ( Fig. 2. ). cortes de tecido da ferida (D3 e D7) de animais diabéticos histoquímica com anticorpo ativa caspase-3 para a visualização de células apoptóticas. Os cortes foram então co-histoquímica usando um anti-neutrófilo ou anti-CD31 (marcador de células endoteliais) anticorpo Figo. 2A e B ). Os resultados demonstram claramente que a maioria no dia 3 de caspase-3 células positivas foram os neutrófilos. Algumas células endoteliais foram positivos para caspase-3 no 7 º dia pós-ferimento. Estes dados sugerem PMN e células endoteliais pelo menos em parte, representam a apoptose detectada em feridas. 

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Figura 1. Aumento do número de células apoptóticas em feridas de ratos diabéticos e os seres humanos. 

 

Um mosaico, imagens Representante do dia 3 de feridas db (diabéticos / db) ou não-diabéticos (db / +) ratos corados com caspase ativa 3 (marrom). De contraste foi realizada com hematoxilina (azul). O mosaico de imagens de feridas todo foram coletadas em 20 × ampliação MosaiX guiado por software (Zeiss) e um palco motorizado. Cada imagem do mosaico foi gerada pela combinação de imagens 14/12. Detalhe: a ampliação da imagem superior da área de caixa marcada na imagem de mosaico. barra de escala ( inset = 10 mm), B-C , a quantificação da atividade da caspase 3 ativa ( B ) ou TUNEL células positivas ( C ). Os dados são apresentados como média ± SD (n = 3) *, p <0,05 versus controle não diabéticos (db / +) ratos; D . A Western blot imagem representativa da ativa caspase-3 (CASP-3) e GAPDH (limpeza), em tecido, dia3 extratos de db (diabéticos / db) ou não-diabéticos (db / +) ratos. E . dados de Densitometria blot mostrado no painel D. Os dados apresentados são média ± SD (n = 3). *, P <0,05 em relação ao db / + ratos; F-G , ferida biópsias foram obtidas de diabéticos ou não diabéticos apresentaram no ambulatório de feridas. Exemplares (3 mm punch) foram obtidos a partir da borda da ferida usando imunoistoquímica da caspase 3 ativa marrom) anticorpo (como marcador de células apoptóticas. De contraste foi realizada com hematoxilina (azul); F . imagens microscópicas, as setas indicam células positivas. Barra de escala = 50 mm; G , a quantificação da atividade da caspase 3 ativa áreas positivo mostrado na F. Os dados apresentados são média ± SD (n = 3) * p<0,05 versus non feridas pé diabético. 

doi: 10.1371/journal.pone.0009539.g001 

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Figura 2. Identificação de neutrófilos apoptóticos e células endoteliais em feridas diabéticas. 

 

Representante immunostained seção: Um dia 3, ferida mostrando neutrófilos (verde) e ativos CASP-3 (vermelha) de coloração e B , no dia 7 ferida mostrando células endoteliais (CD31, verde) e ativa CASP-3 (vermelha) de coloração. Nuclear de contraste foi realizada com DAPI (azul). i , de baixa potência (20x) imagens, barra de escala = 50 μm.; IV-II , de imagens de alta potência da área encaixotado i mostrando ativos CASP-3 (vermelho) e DAPI ( azul) (ii) anti-neutrófilo ou anti-CD31 (verde) e DAPI (azul) (iii) e as imagens fundidas de anti-neutrophil/anti-CD31 e ativo CASP-3. Casp3 neutrófilos positivo / células endoteliais são mostradas com setas brancas. Escala de bar ( A II-IV e B ii iv) = 10 μm. 

doi: 10.1371/journal.pone.0009539.g002 

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A Tabela 1. característica demográfica dos pacientes e seus tamanho da ferida / idade. 

doi: 10.1371/journal.pone.0009539.t001 

 

Para testar se o aumento do estresse oxidativo em ratos diabéticos contribui para o aumento do número de células apoptóticas em feridas, os ratos diabéticos foram suplementados (tratadas por gavage) por dia, com N-acetilcisteína (NAC). NAC é um antioxidante conhecido bem eficaz na redução do estresse oxidativo em ratos diabéticos na dose acima [19], [20]. Após três semanas de suplementação, os níveis de peroxidação lipídica no plasma foram medidos como marcador de estresse oxidativo. Os dados apresentados na fig. S1A demonstrar que os ratos diabéticos, comparados aos não-diabéticos pareados ratos, mostram níveis significativamente elevados de peroxidação lipídica. NAC suplementação por três semanas, diminuiu significativamente a peroxidação lipídica no plasma ( Fig. S1A ). 4-hidroxi-2-nonenal (HNE) é um dos principais produtos de peroxidação lipídica endógena, que é encontrado como uma pegada na sequência do estresse oxidativo [21]. Anti-HNE coloração demonstrou que semelhante ao plasma, tecido, de db / db apresentam níveis mais elevados de estresse oxidativo, que é amenizada após suplementação com NAC ( Fig. S1B ). Apesar do estresse oxidativo após a suplementação com NAC atenuou, nenhuma mudança na contagem de células apoptóticas em feridas foi observado nos camundongos diabéticos ( Fig. s1c ). Estas observações argumentar contra o envolvimento do estresse oxidativo na determinação da carga de celular por apoptose no tecido, de ratos diabéticos. 

 

Para avaliar clearance atividade celular por apoptose, macrófagos suspensões ferida homogêneos foram obtidos a partir de diabéticos e não diabéticos (controle) ratos. macrófagos da ferida foram isoladas empregando um álcool de polivinila (PVA), esponja de abordagem de implantação. Este processo de isolamento resultou em culturas de macrófagos com mais de 95% (95,9 ± 1,7%) homogeneidade. -Macrófagos local da ferida, foram co-cultivados com células-tracker (vermelho), marcou as células que eram viáveis ou apoptose ( Fig. 3. ). Timócitos apoptóticos foram feitas por ativá-los com 5 mM de dexametasona por 12 h. Mais de 90% de células se fosfatidilserina (PS) positiva ( Fig. 3A ). A co-cultura resultou em clasping ( Fig. 3B ) e fagocitose dos fluorescente etiquetado células apoptóticas ( Figs. 3C ). Os macrófagos são phagocytotically silenciosa quando co-cultivadas com células viáveis ( Fig. 3D ). A diferença entre a observação Figs. 3D & E foram testadas objetivamente através de escores ( Fig.. 3H ). powered DIC ou imagens de alta fluorescência foram utilizados para discriminar entre aderente e engoliu celular por apoptose ( Fig.. 3F & G ). Significativamente prejudicada apuramento celular por apoptose ou efferocytosis atividade dos macrófagos isolados de feridas de ratos diabéticos foi observado ( Fig. 4. ). Buscou-se testar se o comprometimento da célula apuramento atividade apoptótica de macrófagos da ferida foi limitada ao db / db modelo ou macrófagos provenientes de outros modelos de ratos diabéticos apresentam resultados comparáveis. Para resolver este problema, usamos outros modelos genéticos de diabetes tipo 1. O NOD / mice LTJ são suscetíveis ao desenvolvimento espontâneo do tipo de (auto-imune 1) diabetes mellitus insulino dependente (IDDM) [22]. Da mesma forma, B6-Ins2Akita modelo do tipo 1 diabetes espontâneo é um modelo relativamente novo de não-obesos diabéticos insulino-dependentes [22]. Consistente com os resultados da db db ratos / ferida macrófagos derivados de NOD, bem como de camundongos Akita mostrou aumento do número de células em apoptose no tecido da ferida (dados não mostrados), bem como deficiências claras na célula apuramento atividade morto ( Figs. 4C & D ) . Resultados abordando o tempo de curso demonstram que a ferida macrófagos colhidos de forma ratos diabéticos não durante a fase inflamatória precoce (3 º dia pós-ferimento) possuem mais de apuramento atividade celular por apoptose ( Fig.. 4B ). Esta atividade é atenuada durante o dia (intermediário 7) ou tarde (dia 15) as fases da cicatrização ( Fig.. 4B ). Comparados aos controles, a atividade fagocitária foi marcadamente prejudicada em macrófagos de camundongos diabéticos em todos os pontos analisados ( Fig.. 4B ). 

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Figura 3. apuramento de células mortas por macrófagos site enrolado. 

 

Para celular apuramento ensaio mortos, ferida macrófagos foram co-cultivados com células-Tracker rotulado (vermelho) timócitos. A , timócitos apopotosis detectado utilizando anexina V (com FITC). Anexina V se liga a exteriorizada fosfatidilserina (PS), a características de células apoptóticas. Esse tratamento resultou em mais de 90% de células tornando fosfatidilserina (PS) foram positivos. Os dados são média ± DP, p <0,05 (n = 4). B , F4/80-FITC (verde) e DAPI (azul, nuclear) de macrófagos corados ferida que estabelece ligação com uma timócitos apoptóticos (vermelho); C , ferida de macrófagos ( F4/80-FITC e DAPI corados) envolveu um número de glóbulos vermelhos timócitos apoptóticos; D , co-culturas de controle (sem tratamento, viável ) timócitos (vermelho) com macrófagos da ferida (imagem DIC), seguido de lavagem; E , co-culturas de timócitos apoptóticos (vermelho) com macrófagos da ferida (o contraste da imagem diferencial, a imagem DIC), seguido de lavagem; F-G , representante da imagem de um grande aumento de macrófagos no DIC ( F ) ou corados com F4/80 FITC (verde, G ), mostrando engulfed e respeitado (setas brancas) timócitos apoptóticos (vermelho). H , marcando de timócitos tragado por macrófagos. Os dados são apresentados comoíndice fagocitário que é definido como o número total de células apoptóticas fagocitadas por macrófagos, em um campo de visão dividido pelo número total de macrófagos apresentado na vista. Esta abordagem permite que a normalização dos dados no número de macrófagos. Dados apresentados como média ± DP (n = 3). *, p<0,01 em comparação com macrófagos co-cultivados com timócitos controle. 

doi: 10.1371/journal.pone.0009539.g003 

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Figura 4. Dead atividade apuramento célula é danificada em macrófagos local da ferida colhidos de camundongos diabéticos. 

 

Um , imagens representativas de macrófagos (contraste de fase) de diabéticos (/ db db) e os não diabéticos controle pareados (db / +) co-cultivados com timócitos apoptóticos (vermelho);B-D , a quantificação de células de apuramento atividade morto da ferida macrófagos provenientes de três diferentes origens genéticas; B , o índice fagocitário dos macrófagos da ferida colhidos 3, 7 ou 15 dias pós-implantação do db / não (diabéticos controle +) ou db / db (diabetes tipo 2); C , o índice fagocitário de macrófagos da ferida colhida a implantação de cinco dias pós NOR (controle) ou NOD (diabetes tipo 1) e D , o índice fagocitário dos macrófagos da ferida colhidos cinco dias pós-implante de Akita (Ins2Akita, diabetes tipo 1) e C57Bl6 (controles não-diabéticos). Os dados são média ± SD (n = 3) .* p <0,05 versus ratos do controle. 

doi: 10.1371/journal.pone.0009539.g004 

 

Transient inflamação é um componente integral do processo de cura bem sucedida [23]. Embora os mecanismos de inflamação derivados apoio cura processos-chave, tais como, remoção de entulhos e angiogênese, é necessário que a inflamação ser resolvido em tempo hábil para permitir que o restante da cascata de cicatrização a seguir [23]. Para abordar os mecanismos envolvidos na definição da inflamação da ferida, tecido, foi colhida a partir de ratos diabéticos e seus controles correspondentes, nos dias 1, 3, e 7 º dia pós-ferimento. Em comparação aos ratos controle correspondente, os ratos diabéticos apresentaram níveis aumentados de citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-6. Dos juros, IL-10, uma citocina anti-inflamatória, foi significativamente menor nas feridas diabéticas tecido ( Fig. 5A ). Esta linha de evidências demonstra um desequilíbrio entre-inflamatórios e anti-inflamatórios citocinas pró na ferida diabética resolução atempada de antagonizar a inflamação. Os macrófagos representam uma importante fonte de citocinas na ferida. Assim, a produção de citocinas por macrófagos isolados de feridas e camundongos diabéticos controle foi analisada. macrófagos da ferida de db / db e db / animais do grupo controle + foram isoladas e cultivadas durante a noite. Em seguida, as citocinas pró-inflamatórias TNFa, IL-6 foram analisados a partir do meio de cultura. Macrófagos de ratos diabéticos produziu níveis mais altos de citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-6 e menor anti-inflamatórias das citocinas IL-10 em comparação com controles não-diabéticos ( Fig. 5B ). Tomados em conjunto, os resultados a partir de tecido da ferida ( Fig.. 5A ), bem como isoladas ferida site macrófagos ( Fig.. 5B ) demonstram que o padrão de expressão de citocinas na ferida diabética resistem a resolução da inflamação levando a uma fase inflamatória prolongada. 

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Figura 5. inflamatória aumentada de citocinas pró-níveis em feridas diabéticas e em macrófagos local da ferida. 

 

A , os níveis de citocinas no tecido da ferida excisional coletadas nos dias 1, 3 e 7 pós-ferimento foram medidos através de ELISA. Os dados são apresentados como pg níveis de citocinas por mg de tecido úmido. Média ± SD (n = 5) .* p <0,05 db / db versus db / +; B , esponjas PVA foram colhidos nos dias 3, 7 ou 15 após o implante e os macrófagos foram isoladas. Macrófagos (1 × 10 6) foram semeadas em placas bem 6. Níveis de citocinas em meios de cultura foi medida 24 h pós-semeadura utilizando ELISA. Média ± DP (n = 4). *, p <0,05 db / db versus db / +. 

doi: 10.1371/journal.pone.0009539.g005 

 

Na próxima fase do estudo que procurou tratar de saber se existe uma ligação entre o maior peso observado de células apoptóticas em pacientes diabéticos ferida e resolução diminuída de inflamação da ferida e encerramento. Para aumentar a carga celular por apoptose no local da ferida com a mínima perturbação de outros aspectos da biologia da ferida, JO2 (anti-CD95) ou o seu controle isotípico (IgG2), anticorpos foi aplicada topicamente a ferimentos, uma vez por dia durante a fase inflamatória precoce (0-4 d ferindo post). Esta abordagem levou a uma maior carga significativa de células apoptóticas no local da ferida ( Fig.. 6A-D ). O antígeno Fas é uma morte de domínio que contém proteína de superfície celular que está presente em muitos tipos de células [24]. Nosso objetivo, ao utilizar esta abordagem, foi aumentar a carga celular por apoptose mediada causada por matar fas de neutrófilos. No entanto, reconhecemos que há uma possibilidade de que outros tipos de células grandes , por exemplo queratinócitos e macrófagos presentes no tecido da ferida pode ser morto por JO2. Assim, optou-se experimentalmente endereço desta complicação potencial. Os resultados mostraram que células de crescimento de queratinócitos ponta não foram afetados pelo tratamento anti-CD95 JO2 ( Fig. 6E ). macrófagos da ferida também não foram afetados pelo tratamento anti-CD95 JO2 (dados não mostrados). Estes resultados são consistentes com os relatórios publicados mostrando que estes dois tipos de células são resistentes tanto a apoptose mediada por CD95 [25],[26]. De primordial interesse foi a constatação de que o aumento da contagem de células apoptóticas no local da ferida causada aumento significativo de citocinas pró-inflamatórias (TNFa, IL-1β e IL-6) e diminuição da expressão de citocinas anti-inflamatórias (IL-10 e TGFβ1) níveis no local da ferida, nos dias 1 e 3 pós-ferimento ( Fig. 7. ). Essa resposta inflamatória aumentada em um JO2 feridas tratadas estava associado com o fechamento prejudicada manifestada por área da ferida expandido ( Fig. 6F ). 

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Figura 6. A aplicação tópica de Fas-ativar anti-CD95 JO2 na ferida site aumentou a contagem de células apoptóticas, enquanto não induzir a apoptose em ceratinócitos. 

 

A visualização de células apoptóticas TUNEL manchada no dia 5 tecido, tratada com anti-CD95 de murino (clone: JO2, 2 mg / ferida) ou veículo contendo controle isotípico (IgG2). controle positivo (tecido, tratada com proteinase K e nuclease), mostrando células apoptóticas TUNEL positivas com mancha verde núcleos; B , marcando de células em apoptose no tecido da ferida seções coradas com TUNEL. *, p <0,05 em relação ao veículo-tratados feridas emparelhadas; C , a Western blot imagem representativa da ativa caspase-3 (CASP-3) e GAPDH (limpeza) em extratos de tecidos de IgG2 ou JO2 tratados d3 feridas; D , densitométrica dados de borrão mostrado no painel C. Os dados apresentados são média ± SD (n = 3). *, P <0,05 em comparação com IgG2 feridas tratadas; E , JO2 tratamento não induziu apoptose dos queratinócitos. Queratina-14 (verde), ativa a caspase-3 (vermelho) e DAPI (azul) a migração epitelial ponta manchada de placebo (à esquerda) ou tratados JO2 (à direita) feridas. Barra de escala = 20 μm. Active caspase-3 de coloração foi observada no tecido de granulação, mas não a no-proliferativa do epitélio hiper ou ponta epitelial após o tratamento JO2; F , ferida área em percentagem da ferida inicial determinada em três dias após o ferimento. Os dados são apresentados como média ± SD (n = 4) .* p <0,05 versus IgG2 controle correspondente tratados ferida. 

doi: 10.1371/journal.pone.0009539.g006 

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Figura 7. Aumentar a carga da pilha morta em feridas resultou num aumento de citocinas inflamatórias, os níveis de profissionais. 

 

tecidual de feridas tratadas com anti-CD95 JO2 ou IgG2 controle foram colhidas nos dias 0, 1 e 3 pós-ferimento. Níveis de citocinas de pares (controle e tratado) tecido feridas foram mensuradas por ELISA no pós-indicada ferindo dias. Aumento significativo de citocinas pró-inflamatórias (TNFa, IL-6, IL1β) e diminuição nos níveis de citocinas anti-inflamatórias IL-10 e TGFβ1 foi observado nas feridas que tinha aumentado a carga celular por apoptose. Os dados (média ± SD, n = 5) são apresentados como pg de citocinas por mg de tecido. *, p <0,05 em relação ao lado controle IgG tratados. 

doi: 10.1371/journal.pone.0009539.g007 

 

Finalmente, testamos a hipótese de que efferocytosis sucesso "interruptores" os macrófagos da ferida de um modo pró-inflamatórias em um modo anti-inflamatórios. Após effecrocytosis ferida macrófagos foram ativados com IFN-LPS e γ para induzir a expressão do TNF-α, como um marcador de mediador pró-inflamatório. A supressão significativa do gene TNFa induzível e expressão da proteína foi observado no pós-fagocitose (macrófagos co-cultivados com células em apoptose) em comparação com os macrófagos, que não fagocitam (cultivadas com células viáveis) ( Fig. 8. ). Estas observações indicam que suprime a fagocitose de sucesso inflamatória da expressão do gene pró-nos macrófagos levando ao conceito de que efferocytosis prejudicada na ferida do diabético pode ser responsável pela falta de resolução da inflamação. 

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Figura 8. Efferocytosis de células apoptóticas por macrófagos da ferida resultou na supressão do gene TNFa inflamatório e pró-expressão da proteína. 

 

Após ensaio de apoptose de células de apuramento do-fagocitados timócitos não foram removidos por lavagem e as células foram desafiados com LPS (1 mg / ml) e IFNγ (10 ng / ml) por 4 h (expressão gênica) ou 16 h (a expressão da proteína). TNFa gene ( A ) e proteínas ( B ) a expressão foi avaliada utilizando-PCR em tempo real e ELISA, respectivamente. dados de expressão de mRNA são apresentadas como alterações% em relação ao LPS + IFNγ ativado amostras controle não. dados proteína é expressa como a concentração de TNF-α secretada em meio de cultura. Os dados são média ± DP (n = 4); **,p <0,01 em comparação com macrófagos cultivados com células viáveis. 

doi: 10.1371/journal.pone.0009539.g008 

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A diabetes é conhecido por ser associada com a função fagocítica de macrófagos prejudicada [27],[28], [29], [30], [31], [32]. Achados do presente estudo solteira prova colectivamente apoio que contam aumento de células apoptóticas em feridas cutâneas de ratos diabéticos e humanos está associada com comprometimento de células mortas apuramento atividade de macrófagos da ferida. As principais conclusões deste estudo são que: i) as feridas diabéticas têm maior carga de células em apoptose, que é em parte devido ao afastamento de atividade apoptótica prejudicada dos macrófagos no local da ferida do diabético. Esta conclusão é baseada nas observações que as feridas em diabéticos do rato e humanas têm aumentado a contagem de células apoptóticas essencialmente contribuído por PMNs apoptose, e que macrófagos isolados de feridas diabéticas são prejudicados na sua atividade de fagocitose de células apoptóticas; ) ii aumento da carga de celular por apoptose em feridas diabéticas aumenta a resposta inflamatória em feridas. Esta conclusão é baseada na observação experimental de que a elevação da carga de celular por apoptose no local da ferida resultou em aumento da resposta inflamatória, e iii) células mortas apuramento atividade prejudicada em macrófagos da ferida diabética compromete a resolução da inflamação em feridas diabéticas. Esta opinião é corroborada pela observação de que a depuração da bem-sucedida de células apoptóticas por macrófagos da ferida atenua a expressão de citocinas inflamatórias e que os macrófagos da ferida do diabético, prejudicado em sua capacidade de fagocitose, produzem níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias. 

 

Elevado número de células apoptóticas é uma característica conhecida da ferida do diabético [33]. Outros factores que não a fagocitose por macrófagos prejudicado, tal como proposto neste estudo, que pode contribuir para a contagem de células apoptóticas elevados na ferida diabética incluem aceleração da apoptose causada por produtos finais da glicação avançada (AGEs), ativação da proteína quinase C (PKC) e aumentou estresse oxidativo [34]. Em apoio da glicação estar envolvido na aceleração da apoptose de neutrófilos no sangue periférico de pacientes com DM2 uma associação estreita entre as taxas de apoptose com HbA1c elevada tem sido relatada [35]. Implicações do estresse oxidativo na apoptose acelerada em diabéticos têm sido propostos [36]mas não é suportado por observações do presente estudo demonstrando a eficácia do NAC como antioxidante, e nenhum efeito dessa intervenção na carga de células apoptóticas no local da ferida. 

 

Outros que apoptose acelerada, o aumento da carga de células apoptóticas no local da ferida pode ser aportado por clearance ineficaz das células apoptóticas, oriundas de ferimentos por macrófagos. macrófagos peritoneais de diabéticos não-obesos (NOD) ratos são conhecidos por invadir células apoptóticas menos eficiente do que os de ratos não-diabéticos [30], [32]. Nossa observação que ferida macrófagos derivados de três diferentes modelos genéticos de diabetes sofrem de função efferocytosis prejudicada é consistente com os relatórios. De um metabólicos e mecânicos relacionados com stand-ponto, NOD e db / db ratos diabéticos têm várias diferenças fundamentais[22], [30], [37]. camundongos NOD desenvolver destruição auto-imune espontânea de células-β em cerca de 5 meses de idade. Este modelo tem uma série de semelhanças com as características da diabetes tipo 1 humano [22]. Em termos de início precoce e um modo dominante autosomal da herança e disfunção primária das células β, ratos Akita lembram a condição de diabetes início maturidade humana dos jovens [38]. Db / db do rato é um modelo estabelecido de cicatrização deficiente associada com diabetes mellitus tipo humano 2 (DM2) [39], [40]. A base genética para este modelo de mouse pura é um gene único defeito autossômico recessivo no receptor da leptina, que produz resistência à leptina, resultando em hiperfagia, obesidade e os sintomas posteriores de resistência à insulina, a secreção insuficiente de insulina, hiperglicemia e elevação da HbA1c (9,1 ± 2,1) níveis [22], [41], [42], [43]. Uma característica comum dos três modelos acima descrito é que todos eles sofrem de hiperglicemia. Hiperglicemia associada avançados produtos finais glicada (AGEs) têm mostrado diretamente suprimir a atividade de fagocitose dos macrófagos[31]. 

 

Inflamação é estreitamente regulada pelos seguintes dois tipos de sinais: i) iniciar e manter a inflamação, e ii) resolver a inflamação [23]. Um desequilíbrio entre os dois sinais, em favor do primeiro, resulta em inflamação crônica e desvia a cascata de cicatrização. Citocinas pró-inflamatórias IL-1α, IL-1β, IL-6 e TNF-α são destaque-se regulamentado durante o processo de reparação [44]. IL-10 é reconhecido como um importante supressor da resposta inflamatória [45]. Um papel importante desta citocina anti-inflamatória na atenuação da expressão de citocinas pró-inflamatórias em feridas fetal, resultando em minimizaram a deposição de matriz e livre de cicatrização tem sido demonstrada [46]. Níveis aumentados de citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-6 e uma diminuição do nível de IL-10, uma citocina anti-inflamatória foram observados no tecido da ferida do diabético em relação ao não-diabético cura da ferida. A modesta mas significativa diminuição em níveis de IL-10 em db / db ferida em relação ao controle não-diabético sugere que a IL-10 não é suficiente para suprimir a resposta inflamatória aumentada nas feridas dos ratos. Curiosamente, o aumento da expressão de IL-10 é conhecida por estar associada com a cura de deficientes em humanos úlceras insuficiência venosa crônica [47], que são conhecidos para ter inflamação persistente. O significado específico do IL-10 na regulação da inflamação da ferida diabética continua a ser caracterizado. Persistentes (dia 13 feridos post) expressão das citocinas inflamatórias IL-1α e TNF-α foi observada em um modelo de cicatrização de feridas excisionais em pacientes diabéticos (db / db) ratos [48]. Redução dos níveis de disposição funcional da citocina pró-inflamatória TNF-α anti-TNF-α utilizando a terapia dirigida a gestão de macrófagos ativados restaurar a cicatrização de feridas em diabéticos ob camundongos ob / [9]. Estas linhas de evidência sugerem que a perturbação de um equilíbrio delicado entre-inflamatórios e anti-inflammatory cytokines pro na ferida do diabético predispõe a ferida com a resolução da inflamação prejudicada [3], [48]. Os macrófagos representam uma importante fonte de citocinas em feridas [44]. A cinética da produção de citocinas por macrófagos da ferida não foi concomitante com a dinâmica do tecido, as citocinas. No entanto, a observação de que macrófagos derivados de feridas diabéticas produz níveis aumentados de citocinas pró-inflamatórias em relação ao controle macrófagos apoio do diabético não que o estado pró-inflamatórias aumentadas de tecido da ferida do diabético é pelo menos em parte devido ao aumento do fenótipo pró-inflamatórias dos macrófagos da ferida do diabético. Esta afirmação é suportada por estudos realizados com ratos, onde macrófagos empobrecido um papel-chave de citocinas em macrófagos da ferida / factor dinâmica de crescimento tem sido demonstrada  

 

FONTE: http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0009539 

 

 

Marcelo Fetha (fetha@ibest.com.br)    

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Disfunção macrofágica danifica resolução da inflamação das feridas de ratos diabéticos 

 

PDF do artigo: acao_macrofagica_nas_feridas_causadas_por_diabetes.pdf 

 

http://amigosdacura.ning.com/profiles/blogs/acao-macrofagica-nas-feridas 

Marcelo Fetha (fetha@ibest.com.br)    



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